Читать онлайн «Эмбрионы, гены и эволюция». Страница 70

Рис. 7-3. Образование гинандроморфов у Drosophila melanogaster. Утрата нестабильной кольцевой Х-хромосомы при одном из ранних делений дробления приводит к образованию двух генотипически различных популяций ядер: XX (темные кружки) и ХО (светлые кружки). Если в клеточной бластодерме эти две популяции разделены по среднесагиттальной плоскости, то образуется мозаичная взрослая муха, у которой одна половина имеет мужскую, а другая - женскую морфологию. Если некольцевая Х-хромосома несет рецессивные гены-маркеры, то они экспрессируются в мужской ХО-половине. На это указывают укороченное крыло и белый глаз (муха в ряду А). Две мухи в нижнем ряду иллюстрируют результаты утраты кольцевой Х-хромосомы, за которой следует разделение либо в передне-заднем (Б), либо в косом (В) направлении (Strickberger, 1976).

Последний метод - индуцированная соматическая рекомбинация - не ограничивается анализом Х-хромосомы, а поэтому имеет несколько более широкое применение. Если данная муха гетерозиготна по какому-либо мутантному гену и его нормальному аллелю, то в результате нормальных митотических делений ядра всех ее клеток будут идентичны и также гетерозиготны. Если, однако, подвергнуть развивающийся организм воздействию рентгеновских лучей, то можно вызвать в его клетках кроссинговер между гомологичными хромосомами (подобно кроссинговеру при мейозе). Клеточное деление, происходящее после такого обмена, может привести к разделению двух кроссоверов (рис. 7-4). Получающиеся в результате дочерние клетки уже не будут гетерозиготными по мутантному гену; одна из них будет гомозиготна по данной мутации, а другая гомозиготна по нормальному аллелю. В дальнейшем дочерние клетки, происходящие от каждого из этих двух реципрокных типов, составят отдельные клоны и в зависимости от своего местоположения в организме животного и времени появления в процессе онтогенеза образуют мозаичные участки разного размера, находящиеся в разных местах тела взрослой особи. Следует указать, что, в сущности, такой мозаичный организм состоит из клеток трех разных типов, потому что два гомозиготных клона возникают на фоне гетерозиготной ткани (рис. 7-4). В этой ситуации можно также определить выживание мутантной ткани по сравнению с нормальной или относительные скорости их роста, потому что если расположить соответствующим образом маркеры в исходной гетерозиготной клетке, то единичный кроссинговер приведет к образованию участков-двойников, т.е. примыкающих одна к другой полосок тканей двух типов. Описанные выше методы создания мозаичных особей позволяют получить данные о специфичности места действия гена для любого дефекта, вызванного мутацией. То или иное морфологическое отклонение, обусловленное каким-либо мутантным геном, может быть результатом непосредственного воздействия данного гена на аномальную ткань как таковую или же результатом неспособности другой, морфологически незатронутой ткани поставлять какой-то компонент, необходимый для нормального развития этой аномальной структуры. Хорошим примером служит сцепленный с полом ген vermilion (v) у дрозофилы. У мух с мутацией v глаза ярко-красные в отличие от темно-красных глаз мух дикого типа. Это отклонение от нормы обусловлено тем, что у v-мутантов не синтезируются коричневатые пигменты - оммохромы, обычно содержащиеся в глазу. При помощи метода анализа мозаичных особей можно показать, что нарушение синтеза пигмента локализовано не в самом глазу. Например, у гинандроморфных мух с мужскими, а следовательно, v-мутантными головой и глазами и женским v+ - туловищем глаза имеют нормальную пигментацию. Создавая мозаиков, содержащих нормальные и мутантные ткани в различных соотношениях, удалось установить, что на самом деле одна из стадий синтеза недостающего пигмента происходит в жировом теле личинки. Затем продукт, создаваемый на этой стадии, очевидно, переносится в развивающийся глаз, где он используется для образования глазного пигмента. Таким путем действительно можно различать истинные и относительные плейотропные эффекты любого генетического повреждения.

Рис. 7-4. Тест на выявление клеточной автономии летального фактора, основанный на соматическом кроссинговере, индуцированном рентгеновскими лучами. А. Вид грудного отдела D. melanogaster со спинной стороны. Два клона клеток, возникшие в результате соматического кроссинговера, образовали два участка-двойника, из которых один несет желтые, а другой - опаленные (singed) щетинки. Наличие «желтого клона» показывает, что летальный фактор неавтономен в своем действии. Б. Генотип по Х-хромосоме из гетерозиготной клетки, которая после кроссинговера дает начало двум гомозиготным дочерним клеткам, у - желтая окраска тела; l - летальный фактор; sn - опаленные щетинки (Hadorn, 1961).

Сочетая эти наблюдения с определением самых ранних отклонений от нормы, выявляемых в мутантном организме, иногда удается установить вероятные причинно-следственные зависимости и начать понимать природу данного генетического дефекта. Если, однако, наблюдаемая летальная фаза наступает на очень ранних стадиях развития, прежде чем сформируются обособленные структуры или органы, то определение точного места действия рассматриваемого гена затрудняется. Ранняя летальность может быть вызвана двумя разными причинами: отсутствием у зародыша какой-то необходимой биохимической функции (например, одного из элементов механизма белкового синтеза) или нарушением какой-либо ранней, но определенной морфогенетической активности. Как же нам различать дефекты этих двух типов? Один из способов состоит в определении времени действия изучаемого гена. Отсутствие функции, без которой совершенно невозможно обойтись и которая необходима всем клеткам, должно приводить к летальному исходу на всех стадиях развития и в тканях всех типов. Тот или иной конкретный ген, определяющий морфогенез, должен обладать более точным местом и временем действия.

В идеале нам хотелось бы иметь возможность как-то обойти раннюю летальную фазу, а затем восстановить рассматриваемый генетический дефект. Этого можно достигнуть двумя способами. Первый из них - метод соматической рекомбинации, который дополняется тем, что мутантные клоны индуцируются на разных стадиях онтогенеза. Если анализируемый ген действительно кодирует какую-то совершенно необходимую метаболическую функцию, то мутантные клоны не смогут выжить или создать нормальный фенотип независимо от времени или места их возникновения. Если, однако, этот ген активен в течение какого-то дискретного отрезка времени, то только мутации, возникшие после этого времени, смогут дать клоны клеток, которые выживут и у которых будет происходить нормальный морфогенез. Аналогичным образом мутантные гены, функционирующие только в определенной ткани или органе, не могут обеспечить развитие в этих структурах жизнеспособных клонов или клонов дикого типа. Возможны и такие случаи, когда активность данного гена ограничена дискретным отрезком времени и определенным местом. Мутация такого гена, если она возникла до этого времени, приведет к неспособности соответствующих клонов выжить или образовать нормальные структуры в определенной ткани. Однако мутации, возникшие на последующих стадиях развития, не затронут клетки этой ткани.

Наконец, наиболее информативный, хотя и ограниченный в своей применимости, метод состоит в выявлении условных мутаций, т. е. мутаций, проявляющихся при определенных условиях, например при повышенной температуре. В этом случае, изменяя температурный режим, можно сдвигать начало проявления мутационного эффекта на любой момент развития. (Конечно, при работе с гомойотермными животными мутации такого тина довольно бесполезны.) Рассмотрим в качестве примера температурочувствительный летальный ген дрозофилы, который приводит к гибели особи при 29°С (непермиссивная температура). Если выращивать мух при этой температуре, то мутантные особи гибнут на стадии куколки, тогда как при 20°С развитие протекает нормально. Культуры мутантных мух выращивают сначала при высокой температуре, а затем снижают температуру и наблюдают за судьбой насекомых. В реципрокных экспериментах мух сначала выращивали при низкой температуре, а затем повышали ее. В экспериментах с понижением температуры самый ранний срок проявления летального синдрома означает начало так называемого температурочувствительного периода (ТЧП). В реципрокных экспериментах с повышением температуры определяли самый поздний срок, после которого мутантный фенотип уже не экспрессируется. Этот срок соответствует окончанию ТЧП. Если удается обнаружить дискретный ТЧП, то это может быть подтверждено путем кратковременных воздействий (pulses) на культуры мутантных особей температур, подавляющих их развитие. Кроме того, можно воздействовать кратковременными изменениями температуры только на отдельные отрезки ТЧП, с тем чтобы определить, можно ли частично улучшить фенотип или же устранить некоторые плейотропные эффекты. Зависимость между ТЧП и фактическим временем гибели также может дать ценную информацию, особенно если ТЧП отделен от летальной фазы существенным промежутком времени. Сопоставив такого рода результат с ранними деталями и жизненно необходимыми функциями, можно убедиться, что если данный ген и его продукт необходимы организму постоянно, то ТЧП оказывается не дискретным, а непрерывным. Если же, однако, данная ранняя функция необходима зародышу только на ранних стадиях развития, то, после того как этот период пройден, воздействие непермиссивной температуры не окажется гибельным. Некий жизненно важный путь в необратимом процессе развития завершен. («Судьба мой путь предначертала, он только след ее пера» - Омар Хайям.) Каждый из описанных здесь методов может быть использован для выяснения отдельных вопросов, касающихся характера важных для процесса развития генетических повреждений. Кроме того, при совместном применении нескольких из этих методов можно получить действительно ценные сведения о том, каким образом нормальные гены участвуют в процессе развития. В полезности этого подхода можно убедиться на ряде примеров, таких как результаты, полученные Сузуки (Suzuki) и его сотрудниками при анализе двух температурочувствительных леталей у Drosophila melanogaster.