Читать онлайн «Медицинская микробиология, иммунология и вирусология». Страница 180

Деление дифтерийных бактерий на биотипы было произведено с учетом того, при каких формах течения дифтерии у больных они выделяются с наибольшей частотой. Тип gravis чаще выделяется от больных с тяжелой формой дифтерии и вызывает групповые вспышки. Тип mitis вызывает более легкие и спорадические случаи заболеваний, а тип intermedius занимает промежуточное положение между ними. C. belfanti, ранее относимый к биотипу mitis, выделен в самостоятельный, четвертый, биотип. Его главное отличие от биотипов gravis и mitis – способность восстанавливать нитраты в нитриты. Штаммы C. belfanti обладают выраженными адгезивными свойствами, и среди них обнаруживаются как токсигенные, так и нетоксигенные варианты.

Рис. 103. Рост биотипов Corynebacterium diphtheriae на среде с теллуритом:

1 – gravis; 2 – intermedius; 3 – mitis

Таблица 44

Дифференциальные признаки, отличающие C. diphtheriae от некоторых дифтероидов

Примечание.(+) – признак положительный; ( – ) – признак отрицательный; (+)( – ) – признак иногда положительный, иногда отрицательный; а – проба Пизу выявляет наличие цистиназы.

Таблица 45

Дифференциальные признаки биотипов gravis, intermedius и mitis

Антигенная структура коринебактерий очень гетерогенна и мозаична. У возбудителей дифтерии всех трех типов обнаружено несколько десятков соматических антигенов, по которым их делят на серотипы. В России принята серологическая классификация, по которой различают 11 серотипов дифтерийных бактерий, из них 7 основных (1 – 7) и 4 дополнительных, редко встречающихся серотипов (8 – 11). Шесть серотипов (1, 2, 3, 4, 5, 7) относятся к типу gravis, а пять (6, 8, 9, 10, 11) – к типу mitis. Недостатком метода серотипирования является то, что многие штаммы, особенно нетоксигенные, обладают спонтанной агглютинацией или полиагглютинабельностью.

Фаготипирование C. diphtheriae. Для дифференциации дифтерийных бактерий предложены различные схемы фаготипирования. По схеме М. Д. Крыловой с помощью набора из 9 фагов (A, B, C, D, F, G, H, I, K) удается типировать большинство токсигенных и нетоксигенных штаммов типа gravis. С учетом чувствительности к указанным фагам, а также культуральных, антигенных свойств и способности синтезировать корицины (бактерицидные белки) М. Д. Крылова выделила 3 самостоятельные группы коринебактерий типа gravis (I – III). В каждой из них имеются подгруппы токсигенных и их нетоксигенных аналогов возбудителей дифтерии.

Резистентность возбудителей дифтерии. C. diphtheriae проявляет большую устойчивость к низким температурам, но быстро погибает при высокой температуре: при 60 °C – в течение 15 – 20 мин, при кипячении – через 2 – 3 мин. Все дезинфицирующие вещества (лизол, фенол, хлорамин и др.) в обычно применяемой концентрации уничтожают ее за 5 – 10 мин. Однако возбудитель дифтерии хорошо переносит высушивание и может долго сохранять жизнеспособность в высохшей слизи, слюне, в частичках пыли. В мелкодисперсном аэрозоле дифтерийные бактерии сохраняют жизнеспособность в течение 24 – 48 ч.

Факторы патогенности. Патогенность C. diphtheriae определяется наличием ряда факторов:

1. Факторов адгезии, колонизации и инвазии. Структуры, ответственные за адгезию, не идентифицированы, однако без них дифтерийная палочка не смогла бы колонизировать клетки. Их роль выполняют какие-то компоненты клеточной стенки возбудителя. Инвазивные свойства возбудителя связаны с гиалуронидазой, нейраминидазой и протеазой.

2. Токсического гликолипида, содержащегося в клеточной стенке возбудителя. Он представляет собой 6,6'-диэфир трегалозы, содержащий коринемиколовую кислоту (С32Н64О3) и коринемиколиновую кислоту (С32Н62О3) в эквимолярных отношениях (трегалозо-6,6'-дикоринемиколат). Гликолипид оказывает разрушающее действие на клетки ткани в месте размножения возбудителя.

3. Экзотоксина, обусловливающего патогенность возбудителя и характер патогенеза заболевания. Нетоксигенные варианты C. diphtheriae дифтерии не вызывают.

Экзотоксин синтезируется в виде неактивного предшественника – единой полипептидной цепи с м. м. 61 кД. Его активация осуществляется собственной бактериальной протеазой, которая разрезает полипептид на два связанные между собой дисульфидными связями пептида: А (м. м. 21 кД) и В (м. м. 39 кД). Пептид В выполняет акцепторную функцию – он распознает рецептор, связывается с ним и формирует внутримембранный канал, через который проникает в клетку пептид А и реализует биологическую активность токсина. Пептид А представляет собой фермент АДФрибозилтрансферазу, который обеспечивает перенос аденозиндифосфатрибозы из НАД на один из аминокислотных остатков (гистидина) белкового фактора элонгации EF-2. В результате модификации EF-2 утрачивает свою активность, и это приводит к подавлению синтеза белка рибосомами на стадии транслокации. Токсин синтезируют только такие C. diphtheriae, которые несут в своей хромосоме гены умеренного конвертирующего профага. Оперон, кодирующий синтез токсина, является моноцистронным, он состоит из 1,9 тыс. пар нуклеотидов и имеет промотор toxP и 3 участка: toxS, toxA и toxB. Участок toxS кодирует 25 аминокислотных остатков сигнального пептида (он обеспечивает выход токсина через мембрану в периплазматическое пространство бактериальной клетки), toxA – 193 аминокислотных остатка пептида А, и toxB – 342 аминокислотных остатка пептида В токсина. Утрата клеткой профага или мутации в tox-опероне делают клетку малотоксигенной. Напротив, лизогенизация нетоксигенных C. diphtheriae конвертирующим фагом превращает их в токсигенные бактерии. Это доказано однозначно: токсигенность дифтерийных бактерий зависит от лизогенизации их конвертирующими tox-коринефагами. Коринефаги интегрируются в хромосому коринебактерий с помощью механизма сайт-специфической рекомбинации, причем штаммы дифтерийных бактерий могут содержать в своих хромосомах по 2 сайта рекомбинации (attB), и коринефаги интегрируются в каждый из них с одинаковой частотой.

Генетический анализ ряда нетоксигенных штаммов дифтерийных бактерий, проведенный с помощью меченых ДНК-зондов, несущих фрагменты tox-оперона коринефага, показал, что в их хромосомах имеются последовательности ДНК, гомологичные tox-оперону коринефага, но они либо кодируют неактивные полипептиды, либо находятся в «молчащем» состоянии, т. е. неактивны. В связи с этим возникает очень важный в эпидемиологическом отношении вопрос: могут ли нетоксигенные дифтерийные бактерии превращаться в токсигенные в естественных условиях (в организме человека), подобно тому, как это происходит in vitro? Возможность подобного превращения нетоксигенных культур коринебактерий в токсигенные с помощью фаговой конверсии была показана в опытах на морских свинках, куриных эмбрионах и белых мышах. Однако происходит ли это в ходе естественного эпидемического процесса (и если происходит, то как часто), пока установить не удалось.

В связи с тем, что дифтерийный токсин в организме больных оказывает избирательное и специфическое воздействие на определенные системы (поражаются в основном симпатико-адреналовая система, сердце, сосуды и периферические нервы), то очевидно, он не только угнетает биосинтез белка в клетках, но и вызывает другие нарушения их метаболизма.

Для обнаружения токсигенности дифтерийных бактерий можно использовать следующие способы:

1. Биологические пробы на животных. Внутрикожное заражение морских свинок фильтратом бульонной культуры дифтерийных бактерий вызывает у них некроз в месте введения. Одна минимальная смертельная доза токсина (20 – 30 нг) убивает морскую свинку весом 250 г при подкожном введении на 4 – 5-й день. Наиболее характерным проявлением действия токсина является поражение надпочечников, они увеличены и резко гиперемированы (см. цв. вкл., рис. 102.4).

2. Заражение куриных эмбрионов. Дифтерийный токсин вызывает их гибель.

3. Заражение культур клеток. Дифтерийный токсин вызывает отчетливый цитопатический эффект.

4. Метод твердофазного иммуноферментного анализа с использованием меченных пероксидазой антитоксинов.

5. Использование ДНК-зонда для непосредственного обнаружения tox-оперона в хромосоме дифтерийных бактерий.

Однако наиболее простым и распространенным способом определения токсигенности дифтерийных бактерий является серологический – метод преципитации в геле. Суть его состоит в следующем. Полоску стерильной фильтровальной бумаги размером 1,5 × 8 см смачивают антитоксической противодифтерийной сывороткой, содержащей 500 АЕ в 1 мл, и наносят на поверхность питательной среды в чашке Петри. Чашку подсушивают в термостате 15 – 20 мин. Исследуемые культуры засевают бляшками по обе стороны от бумажки. На одну чашку засевают несколько штаммов, один из которых, заведомо токсигенный, служит контролем. Чашки с посевами инкубируют при 37 °C, результаты учитывают через 24 – 48 ч. Вследствие встречной диффузии в геле антитоксина и токсина в месте их взаимодействия образуется четкая линия преципитации, которая сливается с линией преципитации контрольного токсигенного штамма (см. рис. 73, с. 288). Полоски неспецифической преципитации (они образуются, если в сыворотке кроме антитоксина присутствуют в небольшом количестве другие антимикробные антитела) появляются поздно, выражены слабо и никогда не сливаются с полоской преципитации контрольного штамма.