Читать онлайн «В защиту науки». Страница 44

Таким образом, оптимальные условия замораживания того или иного типа клеток обычно подбирают экспериментально; при этом, конечно, эксперимент строится с учётом основных положений теории Мэйзура. Наиболее «крупными» стадиями в развитии млекопитающих, которые когда-либо удавалось замораживать при помощи традиционных способов, описанных в этом параграфе, являются преимплантационные эмбрионы. Размер пре-имлантационных эмбрионов большинства видов млекопитающих — несколько десятых долей миллиметра, однако это уже многоклеточное образование и зачастую приходится прибегать к разным ухищрениям, чтобы достичь успеха. Тем не менее, эмбрионы лабораторных (Mobraaten, 1986), большинства сельскохозяйственных (Dobrinsky, 2002), некоторых пушных (Lindeberg et al., 2003; Amstislavsky et al., 2006), а также диких (Leibo, Songsasen, 2002) млекопитающих удается успешно заморозить и хранить при температуре жидкого азота. Сразу отметим, что под "успешной заморозкой" мы имеем в виду лишь те случаи, когда после крио-консервации при температуре жидкого азота эмбрионы были разморожены, трансплантированы самке-реципиенту и родилось живое потомство. Это единственный критерий, которому доверяет научное сообщество, все остальные критерии жизнеспособности эмбрионов после разморозки могут вызывать критику (вполне, на наш взгляд, обоснованную).

Когда программное замораживание, основанное на двухфакторной теории Мэйзура, попытались применить к более крупным объектам, чем ранние эмбрионы, то результаты заморозки были в подавляющем большинстве случаев отрицательными. Например, в обзорной статье Якобсена и Пегга сообщалось о попытке насыщения раствором криопротектора некоторых органов, таких, например, как почки, и последующего постепенного охлаждения их до температур -80 °C. Результат был негативным для всех исследованных органов (Jakobsen, Pegg, 1984). Причины неудач подобных экспериментов по применению традиционных программ замораживания при работе с органами перечисляются в ряде обзорных статей (Pegg, 2001; 2006). Органы состоят из разных типов клеток, причем между этими разными типами клеток имеются сложные межклеточные контакты. Каждый тип клеток имеет свои собственные криобиологические характеристики, и программа охлаждения, рассчитанная для одних клеток, может оказаться далеко не оптимальной по отношению к другим. Клеточные контакты особенно чувствительны и чаще всего необратимо разрушаются при применении традиционных программ заморозки. Самое же главное осложнение в применении теории Мэйзура к органам, состоит в том, что их величина измеряется не микронами и даже не миллиметрами. То есть соотношение поверхности и объема у этих органов очень далеко от оптимума. Напомним, что чем больше орган, тем меньше это соотношение поверхности и объема. Теория же Мэйзура хорошо «работает» лишь на объектах, имеющих радиус не более миллиметра.

Альтернативный подход к замораживанию биологических объектов получил название «витрификация». Теоретические основы витрификации с использованием достаточно сложного математического аппарата разрабатывались еще в 1930-х годах Льюетом и его учениками и коллегами (Luyet, Hodapp, 1938). На некоторое время этот подход оказался на втором плане, заслоненный успехами в создании криобанков эмбрионов и семени при помощи методов программного замораживания. Кроме того, казалось, что технически выполнить рекомендации Льюета было несколько сложнее, чем следовать рекомендациям теории Мэйзу-ра. Тем не менее, когда криобиологи столкнулись с проблемами, возникающими при криоконсервации органов, они вспомнили про Льюета и витрификацию. Витрификация была впервые успешно применена для заморозки эмбрионов в 1980-е годы (Fahy et al., 2004). В настоящий момент метод считается перспективным не только для замораживания мелких биологических объектов, таких, как клеточные суспензии (Wusteman et al., 2003), сперматозоиды (Isachenko et al., 2003) и эмбрионы (Kasai, Mukaida, 2004), но также для замораживания срезов органов и тканей (de Graaf, Koster, 2003; Pichugin et al., 2006) и даже для замораживания целых органов (Fahy et al., 2004; Pegg, 2006). Согласно теоретическим предсказаниям Льюета, витрификация позволяет вообще избежать образования кристаллов льда как внутриклеточных, так и внеклеточных. При соблюдении необходимых условий, главными из которых являются очень высокие концентрации криопротек-торов в среде и очень быстрое снижение температуры во время процесса замораживания, замораживаемый объект переходит в "стекловидное состояние", минуя фазу кристаллизации льда. С использованием витрификации недавно удалось успешно заморозить почку кролика до температур -45 °C, причем после размораживания и трансплантации эта почка нормально функционировала (Fahy et al., 2004). Конечно, это еще не криоконсервация, так как под этим термином обычно понимают хранение при температуре жидкого азота, но прогресс в деле создания криобанков органов в последние годы безусловно наметился.

Особенно успешны эксперименты по замораживанию генеративных органов — семенников и яичников. Накапливается все больше экспериментальных и клинических данных о том, что ткань семенника или яичника вполне реально подвергать крио-консервации, и этот подход даже рекомендован как одна из реальных возможностей восстановления плодовитости у людей перенесших химио- и лучевую терапию в связи с лечением рака в раннем возрасте (Hovatta, 2003). Относительно недавно родился первый ребёнок у такой пациентки, у которой до начала химиотерапии были удалены и подвергнуты криоконсервации яичники. После окончания курса лечения и полного выздоровления этой молодой женщине была проведена трансплантация её собственной яичниковой ткани, взятой из криобанка, где кусочки её яичниковой ткани сохранялись при температуре жидкого азота в течение ряда лет. Через некоторое время эта женщина смогла родить собственного ребенка, зачатого естественным путем (Donnez et al., 2004).

Не менее впечатляющи и данные, полученные в экспериментах на животных. В работе Огонуги с соавторами (Ogunuki et al., 2006) сообщается, что удалось получить живое потомство от мертвых мышей. Тушки самцов мышей и выделенные из этих тушек репродуктивные органы хранились в холодильнике при — 20 °C в течение 15 лет. Затем как из сохраненных органов, так и из тушек были выделены сперматозоиды и сперматиды. Причем специальный тест показал, что эти сперматозоиды не только неподвижны, но специальные тесты подтвердили, что они «мертвы», хотя признаков деградации ДНК не было. После инъекции этих сперматозоидов в специально подготовленные ооци-ты (половые клетки самок), некоторые из них стали развиваться. Последующая трансплантациия полученных таким образом эмбрионов привела к рождению потомства. Эта работа показывает, что не столь уж фантастичны проекты восстановления исчезнувших видов животных. Если животное, скажем мамонт или саблезубый тигр, сохранилось в вечной мерзлоте и в его семенниках имеются мертвые сперматозоиды, у которых, однако, сохранен геном, как в описанных выше экспериментах на мышах, то задача получить потомство от этого вымершего животного хоть и технически очень сложна, но все же представляется научно обоснованной даже при современном уровне развития технологий. Взятые от сохраненных в условиях вечной мерозлоты животных сперматозоиды могут быть инъецированы в ооциты ныне живущих родствеников этих вымерших видов и развившиеся эмбрионы могут быть трансплантированы самкам-реципиентам этих видов.

О том, что межвидовая трансплантация является интересным и перспективным научным направлением, мы уже писали как в научных (Amstislavsky et al., 2006б, Амстиславский, 2006а), так и в научно-популярных журналах (Амстиславский, 2006б). Более того, современные достижения в области репродуктивного клонирования (Holt, 2004) показывают, что даже наличие репродуктивных клеток не является, строго говоря, обязательным условием для получения живого потомства от мертвых животных. Группа профессора Лоя из Италии продемонстрировала, что трансплантация ядер соматических клеток от мертвых животных способна привести к рождению живого потомства. Эта научная группа из Италии работает на паре близкородственных видов муфлон — домашняя овца. Муфлон — это самостоятельный вид овец, который в дикой природе обитает на острове Сардиния в Средиземном море. Ядра были получены из кумулюсных клеток (которые не являются половыми клетками, хотя и находятся в яичниках) от муфлонов, найденных мертвыми на пастбище. Последующая трансплантация полученных таким образом эмбрионов овцам-реципиентам привела к рождению живых ягнят муфлона (Loi et al., 2001).

Другим перспективным подходом, о котором нельзя не упомянуть, является криоконсервация срезов органов (de Graaf, Koster, 2003). Недавно была опубликована работа Пичугина с соавторами, в которой авторы продемонстрировали сохранение жизнеспособности клеток одного из отделов головного мозга крыс — гиппокампа после замораживания (витрификации) и хранения при температуре жидкого азота срезов этого отдела мозга (Pichugin et al., 2006). Эта действительно интересная, на наш взгляд, работа была интерпретирована представителями фирмы «Алькор» как в некотором роде доказательство того, что и целиком весь мозг человека можно успешно подвергнуть криоконсер-вации (см. дискуссию к статье Lemler et al., 2004, где работа Пичу-гина с соавторами цитируется как "in press"). Однако толщина срезов гиппокампа в работе Пичугина с соавторами составляла всего 500 микрон. Не надо быть большим специалистом в криобиологии, чтобы понять, что успешно заморозить такой срез несравненно легче, чем заморозить целый мозг. Кроме того, критерии оценки жизнеспособности, применяющиеся в экспериментах по криоконсервации органов и тканей, весьма субъективны и од-носторонни, что обсуждается в недавнем обзоре на эту тему (Pegg, 2006) и с чем мы, со своей стороны, вполне согласны. По мнению Пегга, большинство этих критериев не дает однозначного ответа на вопрос, является ли объект, перенесший криоконсер-вацию «живым» или же «мертвым». Это в полной мере можно отнести и к цитируемой работе Пичугина с соавторами. Применявшийся в данной работе критерий жизнеспособности — способность клеток, перенесших криоконсервацию, поддерживать высокие концентрации внутриклеточного калия еще недостаточен, чтобы утверждать то, например, что нейронные процессы в этих срезах будут протекать точно так же, как и до заморозки. Тем не менее, эта работа является, на наш взгляд, несомненным достижением и показывает, что потенциал методов криобиологии еще далеко не исчерпан и следует ожидать интересных открытий и в будущем.